让找料更便捷
电子元器件
采购信息平台
生意随身带
随时随地找货
一站式电子元器件
采购平台
半导体行业观察第一站
标签：
摘要： RNA原位杂交实验步骤，1. 转录缓冲液：200 mmol/I Tris-HCl （ pH 7.5 ），30 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 亚精胺，0.5%（m/V）BSA。2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT） : 20 U/μl。3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制，过滤除菌。4.
RNA原位杂交实验步骤，
1. 转录缓冲液：200 mmol/I Tris-HCl （ pH 7.5 ），30 mmol/L MgCl
2，10 mmol/L 亚精胺，0.5%（m/V）BSA。
2. 人胎盘核糖核酸酶抑制剂（human placental ribonuclease inhibitor, HPRT） : 20 U/μl。
3. 2 mmol/L DTT : 新鲜配制，过滤除菌。
4. 线状 DNA 模板：通常 0.5~1 μg/μl。
5. SP6，T7 或 T3RNA 聚合酶。
6. 核苷酸溶液：1.25 mmol/L ATP、1.25 mmol/L GTP、1.25 mmol/L CTP、0.312 mmol/LUTP、0. 312 mmol/L 荧光素-11-UTP 溶于灭菌水。
7. 无 RNase 的 DNaseⅠ：用灭菌水新鲜配制，稀释至 10 U/ 80 μl。
8. 4 mol/L NaHCO
3，高压灭菌。
9. 6 mol/L NaHCO
3，高压灭菌。
10. 冰乙酸。
11. 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）高压灭菌。
12. 10 mg/ml 酵母 tRNA。
13. 杂交缓冲液：可用标准杂交缓冲液。这里推荐一种优化缓冲液成品，可从 Amersham 公句购得。缓冲液由以下成分组成：4XSSC，600 μg/ml 鲑鱼精 DNA，2X Denhardt溶液。此杂交缓冲液还含有一种用于提高杂交效率的专利化合物。在使用前，这一缓冲液需用去离子甲酰胺按 1：1 稀释，稀释后的溶液可储存于 -20℃。
14. 20X SSC 储存液：3 mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠（pH7.0 ）。
15. 10% （m/V） SDS。
16. TBS：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 ），400 mmoI/L NaCl。
17. 封闭缓冲液：0.5%（m/V）封闭剂（RPN3023、Amersham International），溶于 TBS。
18. 抗荧光素-碱性磷酸醋酶结合物：可从 Amersham 公司购得。
19. 检测缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （ pH 9.5），100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl
2。
20. NBT 溶液：50 mg/ml 硝基蓝四唑（niroblue tetrazolium，NBT）溶于二甲基甲酰胺。
21. BCIP 溶液：75 mg/ml 溴-氯-吲哚磷酸（bromo-chloro-indolyl phosphate，BCIP ） 溶于70% （ V/V ） 二甲基甲酰胺。
RNA原位杂交实验步骤，二、操作方法
1. 探针标记
（1） 室温下于 1.5 ml 微量离心管中依次加入下列试剂：转录缓冲液 4 μl，0.2 mg/L DTT 1 μl，HPRI 20U，核苷酸溶液 8 μl，线状 DNA 模板 1 μg，RNA 聚合酶 25 U，加水至终体积为 20 μl，轻轻混匀。
（2） 至少保温 2 h。不同的 RNA 聚合酶的保温温度不同，SP6 为 40℃，T3 和 T7 均为 37℃。
（3） 标记的 RNA 探针可储存于 -20℃。
2. 标记探针的纯化及加工
（1） 于 RNA 探针混合液中加入 10 U 无 RNase 的 DNase Ⅰ，37℃ 保温 10 min。
（2） 加入 20 μl 0.4 mol/L NaHCO
3，20 μl 0.6mol/L Na
2CO
3，60 μl 灭菌水。轻轻混匀，于 60℃ 保温进行碱水解。保温时间依转录物的长度及所需探针的大小而定。
（3） 加入 1.3 μl 冰乙酸，20 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ），2 μl 10 mg/ml 酵母 tRNA，500μl 乙醇，于 -20℃ 至少放置 2 h 以沉淀 RNA。
（4） 于微型离心机上用最高速度离心 15 min 沉淀 RNA，弃上清液。
（5） 用 70% 乙醇淋洗沉淀，保持 -20℃：离心 5 min，弃上清液。
（6） 用灭菌水溶解 RNA 探针，并调整 RNA 探针浓度为杂交所需浓度的 10~20 倍，于 -20℃ 保存。
3. 组织及细胞的预处理
用于原位杂交的所有组织可用中性缓冲的甲醛（4%） 固定，醛固定剂能很好的保留细胞 RNA，甲醛灌注动物或刚冰冻的组织切片应固定于室温下的甲醛中，未灌流的组织比灌流的组织更易于进行冰冻切片，更易于附着于载玻片上。
（1） 灌流的组织。
用普通盐水灌流动物以去除血红细胞，接着用约 200 ml 溶于 0.1 mol/L PBS 中的 4% 甲醛溶液灌洗动物，置于 20% 蔗糖（溶于 PBS） 溶液中过夜。将组织冰冻于液氮中并储存于 -80℃。
在约 -20°C 将组织进行切片（10 μm 或更薄 ） 并将切片转移至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
（2） 未灌流的组织。
将新鲜组织冻干于液氮中或冻干保存于冷却至 -30°C 的异戊烷中。将组织进行切片并转至经聚赖氨酸处理的载玻片上。于 -80℃ 储存组织切片。
杂交前从 -80℃ 取出载玻片并于室温下直接置于 4% 甲醛中 1 h。用 PBS 或 2X SSC 彻底洗涤。
RNA原位杂交实验步骤，
对于任何 ISH实验，为取得成功的结果，此步最为重要。每一个杂交系统，均需要它自己的最佳预处理方案。预处理的设计根据这样一个原则：既能使探针与抗体的结合物便于接触到靶分子，又能使组织保持原有的形态结构，并使靶分于保持它原有的位置。另外，预处理方案还可用于设置 ISH 所必需的一些对照实验。
4. 杂交和洗涤
杂交严格件的控制可通过杂交步骤屮的温度、盐浓度和平酰胺的浓度来控制。但是更方便的控制是将这些参数应用到杂交后的严格洗涤上。
（1） 杂交缓冲液于 37℃ 预热 15 min，按 1：1 比例用去离子甲酰胺稀释，充分混匀。
（2） 于杂交缓冲液中加入所需量经 55℃ 预热的探针。300~600 ng/ml 的探针浓度适用于大多数杂交。
（3） 用适当体积的杂交缓冲液/探针混合物覆盖切片。
（4） 将切片放在的电热板上，放置 3~6 min。保温时间取决于靶的类型。
（5） 置切片于湿盒中，按所需温度（典型的是 55℃ ） 及时间进行杂交。
（6） 按所需的严格程度洗涤玻片。典型的洗涤程序包括：1X SSC-0.1%（V/V） SDS 于室温洗两次，每次 5 min；0.2XSSC-0.1%（V/V） SDS 于 55°C 洗两次，每次 10 min。
（7） 为降低本底，可用 RNase 对 RNA 探针进一步处理。此步仅仅除去未杂交的单链探针。具体步骤如下：玻片于 2X SSC 中淋洗 2min 后，于预热的 2X SSC 液（含 RNase A 10 μg/ml ） 37℃ 保温 20~30 min。在进行下一步骤之前，于 2XSSC 中淋洗玻片。
5. 封闭、抗体保温和洗涤
RNA原位杂交实验步骤，
在以下一系列保温中均需轻轻晃动玻片，除非特别声明，否则均于室温下进行。注意：此处所用的 TBS 比标准 TBS 所含的盐浓度更高。
（1） 玻片于 TBS 中洗 5 min。
（2） 置玻片于封闭溶液中保温 1 h。
（3） 于 TBS 中淋洗玻片 1min，沥干玻片上的缓冲液，如有必要，吸干每张玻片表面切片周围的液体。
（4） 按 1：10000 比例，用含 0.5%（ m/V ） BSA 组分 V 的 TBS稀释抗荧光素碱性磷酸酯酶结合物。用抗体覆盖薄片（每张玻片通常用 100 μl），静置保温 1 h。
（5） 玻片于 TBS 中洗 3 次，每次 5 min。
6. 检测
（1） 玻片于检测缓冲液中洗 5 min，沥干每一张玻片上的液体，如有必要，吸干玻片表面切片周围的液体。
（2） 取 45 μl NBT 储存液和 35 μl BCIP 储存液加至 10 ml 检测缓冲液中。每张切片加 500 μl检测试剂，置于暗处显色 4~24 h。
（3） 用蒸馏水淋洗玻片两次，每次 2 min。
（4） 如需要，进行复染。加上封片剂，并盖上盖玻片。
（5） 于光学显微镜下观察结果。
RNA原位杂交实验步骤
| 型号 | 厂商 | 价格 |
|---|---|---|
| EPCOS | 爱普科斯 | / |
| STM32F103RCT6 | ST | ￥461.23 |
| STM32F103C8T6 | ST | ￥84 |
| STM32F103VET6 | ST | ￥426.57 |
| STM32F103RET6 | ST | ￥780.82 |
| STM8S003F3P6 | ST | ￥10.62 |
| STM32F103VCT6 | ST | ￥275.84 |
| STM32F103CBT6 | ST | ￥130.66 |
| STM32F030C8T6 | ST | ￥18.11 |
| N76E003AT20 | NUVOTON | ￥9.67 |